Der Joker attackiert das Büro des Bürgermeisters von Gotham City. Er wird jedoch von Batman gefasst und in die psychiatrische Anstalt Arkham Asylum gebracht. In derselben Nacht bricht ein Feuer in Gotham Citys Blackgate Gefängnis aus, durch das die Stadt gezwungen wird, einige hundert Insassen vorübergehend nach Arkham Asylum zu verlegen. Als Batman den Joker an das Wachpersonal der Psychiatrie übergeben hat, werden diese überwältigt, da die Anstalt von Harley Quinn infiltriert wurde, die dem Joker zur Flucht verhilft. Dieser übernimmt daraufhin die Kontrolle über Arkham Asylum und verbündet sich mit den Insassen. Neben den Gefangenen aus dem Blackgate Gefängnis sind dies zahlreiche Verbrecher, die Batman selbst hinter Gitter gebracht hat. Ihm wird schnell klar, dass das Feuer im Blackgate Gefängnis zu Jokers Plan gehört hat. Der Joker droht in Gotham City verstreute Bomben zu zünden, wenn irgendjemand Arkham Asylum betreten sollte und zwingt Batman so, alleine zu arbeiten. Im Verlauf des Spiels kann er allerdings einige gefangene Wärter befreien und erhält zudem Unterstützung von Commissioner Gordon, um den Insassen das Handwerk zu legen.