Die Handlung des Spiels weist Parallelen zu H. G. Wells Roman Die Insel des Dr. Moreau auf, der die Furcht des Menschen vor der Macht der Naturwissenschaften zum Ausdruck bringt.
Als Spieler steuert man die Hauptfigur des Spiels, Jack Carver, ehemaliger Elite-Soldat der US Marines, der sich zur Ruhe gesetzt hat und sein Geld nun mit Bootsfahrten in Mikronesien (Südpazifik) verdient. Er soll die Journalistin Valerie Constantine zu einer nicht auf Karten verzeichneten Inselgruppe bringen, da Valerie dort angeblich Bilder von japanischen Ruinen aus dem Zweiten Weltkrieg machen will. Bei der Rückfahrt von der Insel wird Carvers Boot jedoch (mit einer Panzerfaust) beschossen und versenkt. Unter Beschuss von unbekannten Söldnern wird er in eine Höhle gespült. Ab diesem Zeitpunkt hat man als Spieler die Kontrolle über die Figur. Im ersten Level findet man ein Funkgerät, über das sich die mysteriöse Figur Harlan Doyle meldet. Er informiert den Spieler über seine Lage und hilft mit nützlichen Hinweisen.

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Die Handlung spielt im fiktiven Hope County, Montana. Ein dort lebender Priester namens Joseph Seed glaubt an einen drohenden Kollaps der Zivilisation und, dass er auserwählt wurde, um die Menschen davor zu beschützen. Dazu gründet er die Organisation „Project at Eden’s Gate“. Die Ideologie dieser Sekte enthält viele Elemente der christlichen Eschatologie, wie z. B. die Vorstellung von den Sieben Siegeln oder dem drohenden Ende der Welt. Eden’s Gate entwickelt sich jedoch zu einem radikalen Kult, der die Menschen zwingt ihm beizutreten und einschüchtert, nicht die Außenwelt zu kontaktieren. Die Mitglieder von Eden’s Gate und die restlichen Bürger von Hope County geraten immer mehr aneinander und es entwickeln sich bewaffnete Konflikte.
Der Spieler ist ein Deputy Sheriff, welcher Mitglied der Hope-County-Widerstandsgruppe ist. Unter ihm soll der Sektenanführer Seed, der sich selbst nur als den „Vater“ bezeichnet, verhaftet werden. Allerdings scheitert die Festnahme und nach einigen Kampfhandlungen wacht der Spieler auf der Insel von Dutch auf, einem Einwohner von Hope County und Gegner der Sekte. Dieser leitet den Spieler fortan auf der Insel (wodurch er in die Spielmechanik eingeführt wird). Wenn die Insel von der Sekte befreit ist, kann sich der Spieler weitgehend frei in der Spielwelt bewegen.

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