Der Spieler schlüpft in die Rolle von Chell, einer jungen Frau, die als Testperson für die Forschungseinrichtung Aperture Science Enrichment Center der Aperture Laboratories fungiert. Aperture Laboratories ist ein Konkurrenzunternehmen der Black Mesa Research Facility, in der Half-Life spielt.
Die Handlung beginnt in einem nur mit dem Nötigsten ausgestatteten Glaskubus. In dieser sterilen, mit Überwachungskameras versehenen Umgebung wird der Spieler von der weiblichen Computerstimme des Genetic Lifeform and Disk Operating System „GLaDOS“ begrüßt und aufgefordert, an Tests teilzunehmen. Diese bestehen aus als „Testkammern“ bezeichneten Hindernisparcours, in denen unter anderem würfelformige Boxen gesucht und auf Bodenschaltern abgelegt werden müssen. Als Belohnung für den erfolgreichen Abschluss aller 19 Kammern wird immer wieder ein Kuchen versprochen.