Die Geschichte spielt zur gleichen Zeit wie die Ereignisse des 1998 erschienenen Resident Evil 2. Die ehemalige S.T.A.R.S.-Offizierin Jill Valentine versucht während einer Zombie-Apokalypse, welche durch den Ausbruch des T-Virus verursacht wurde, aus der fiktiven Stadt Raccoon City zu entkommen. Sie wird von einer mit künstlicher Intelligenz ausgestatteten Biowaffe namens Nemesis verfolgt, die versucht, sie und alle verbleibenden S.T.A.R.S.-Mitglieder zu eliminieren. Das Spiel folgt auch dem Söldner Carlos Oliveira, der von der Organisation Umbrella engagiert wurde, um Überlebende zu finden und ihnen zu helfen.