Die Geschichte spielt vom Freitag dem 19. September bis zum Montag, dem 22. September 2006 in der fiktiven amerikanischen Kleinstadt Willamette, Colorado.
Der Hauptdarsteller, der Fotograf und Journalist Frank West geht merkwürdigen Gerüchten nach, die ihn zu der Kleinstadt führen. Er lässt sich mit einem gecharterten Helikopter in die von der Nationalgarde abgeriegelte Stadt fliegen. Dort fliegt er zunächst die Hauptstraße entlang, dabei beobachtet er einige merkwürdige Dinge. Letztendlich lässt Frank sich spontan auf dem Dach eines Einkaufszentrum absetzen.
Im Einkaufszentrum sieht er sofort die Ursache für die seltsamen Ereignisse. Zombies haben die Kontrolle über die Stadt übernommen und fast alle Einwohner infiziert.
Der Spieler hat nun primär die Aufgabe, die Ursache der Zombieplage aufzudecken. Innerhalb der 72 Stunden, die einem bis zur Abholung durch den Hubschrauber bleiben, gilt es Schlüsselereignisse zu meistern, die zu bestimmten Uhrzeiten auftreten als auch optionale, sogenannte Knüller zu erforschen. Erst nach einmaligem Durchspielen werden weitere Spielmodi freigeschaltet, die die zeitliche Begrenzung aufheben.
Entscheidet man sich zur Aufklärung des Vorfalls, erfährt man, dass die Zombies Ergebnis eines (misslungenen) Experiments in einem amerikanischen Genlabor in Santa Cabeza, der Heimatstadt der Geschwister Isabella und Carlito, sind. Frank West trifft auf kurz oder lang auf Carlito, der das Zombie-Virus in die Stadt brachte, um Rache für die Verwüstung seiner Heimatstadt zu nehmen, und plant, das Einkaufszentrum zu sprengen, um somit die Zombieerreger über weite Teile des Landes zu verbreiten. Nachdem Frank West Carlitos Pläne mit Hilfe von Isabella durchkreuzt hat, wird das Einkaufszentrum gegen Ende der 72 Stunden von regierungsbeauftragten Spezialkräften überrannt, die sämtliche Zombies und Überlebenden zum Zwecke der Geheimhaltung töten sollen. Überlebt Frank diesen Ansturm und kehrt rechtzeitig zum Hubschrauberlandeplatz zurück, sieht er, wie sein Pilot im Hubschrauber von einem Zombie überfallen wird und abstürzt. Frank bricht zusammen und wacht, von Isabella gerettet, in deren Versteck im Einkaufszentrum auf, wo er darüber hinaus erfährt, dass er mit Zombieerregern infiziert ist. Ihm und Isabella bleiben nun 24 weitere Stunden, ein vorübergehendes Gegenmittel zu erstellen. Schaffen sie dies, flüchten sie durch einen Tunnel aus dem Einkaufszentrum, und müssen sich letztendlich dem Befehlshaber der Spezialkräfte stellen. Nach dem Kampf, umringt von Zombies auf einem Panzer, erleidet Frank einen Zusammenbruch in welchem Zuge Sand in seine Kamera kommt und das Display kaputt geht, ob er nun zum Zombie wird und Isabella seine Fotografien auf eigene Faust veröffentlicht oder Frank der Situation entkommen kann, bleibt offen.

Die Geschichte spielt zur gleichen Zeit wie die Ereignisse des 1998 erschienenen Resident Evil 2. Die ehemalige S.T.A.R.S.-Offizierin Jill Valentine versucht während einer Zombie-Apokalypse, welche durch den Ausbruch des T-Virus verursacht wurde, aus der fiktiven Stadt Raccoon City zu entkommen. Sie wird von einer mit künstlicher Intelligenz ausgestatteten Biowaffe namens Nemesis verfolgt, die versucht, sie und alle verbleibenden S.T.A.R.S.-Mitglieder zu eliminieren. Das Spiel folgt auch dem Söldner Carlos Oliveira, der von der Organisation Umbrella engagiert wurde, um Überlebende zu finden und ihnen zu helfen.

Der Vorspann zeigt, wie nachts ein Trucker mit einem Tanklaster fährt und dabei einen Hamburger isst. Nachdem er mit seinem Fahrzeug eine Gestalt anfährt, hält er sein Gefährt an und steigt aus, um nachzusehen, was er mit seinem Fahrzeug erfasst hat. Bei der auf der Straße liegenden Gestalt handelt es sich um eine Frauenleiche, die sich als Zombie entpuppt und den LKW-Fahrer anfällt, nachdem dieser sie zu untersuchen versucht.
Das eigentliche Spiel beginnt anschließend mit dem Prolog. Die beiden Spielercharaktere sind jeweils auf dem Weg in die fiktive Stadt Raccoon City. Leon S. Kennedy, um seine Stelle als Polizist im örtlichen Polizeirevier anzutreten, und Claire Redfield, um nach ihrem vermissten Bruder Chris zu suchen, welcher in der Spezialeinheit S.T.A.R.S. tätig war. Der gespielte Charakter hält vor der Stadt an einer Tankstelle, die der Spieler untersuchen muss. Es stellt sich heraus, dass sich Zombies darin aufhalten und beim Verlassen der Tankstelle trifft die Spielfigur auf den jeweils anderen Spielcharakter. Gemeinsam flüchten die beiden anschließend vor den Zombies an der Tankstelle und setzen ihren Weg zusammen im Auto nach Raccoon City fort.